大家好，我是小菜雞張三，萬(wàn)萬(wàn)沒(méi)想到師兄讓我寄幾獨立做 ELISA 了。這個(gè)我懂，平時(shí)跟著(zhù)師兄勤學(xué)苦練，拍板加樣我是有模有樣。

待我左手一個(gè) OD450 nm，右手一個(gè) 540，納尼？化學(xué)發(fā)光法 ELISA 說(shuō)明書(shū)上怎么沒(méi)有 OD 值的要求??？「少年郎，不是所有的 ELISA 都要測 OD 值喲?！拱抵杏^(guān)察已久的師兄得意揚揚地飄過(guò)。

下面是小博士上課時(shí)間

什么是化學(xué)發(fā)光法 ELISA？

酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）。首先將酶直接標記在抗原或抗體上，再經(jīng)過(guò)抗原與抗體結合形成抗原抗體免疫復合物。通過(guò)不同底物與酶反應后產(chǎn)生的特定產(chǎn)物的特性，達到定量檢測特定分子的目的。根據底物及相應產(chǎn)物的不同，ELISA 可分為比色法（Colorimetric）與化學(xué)發(fā)光法（Chemiluminescent）兩類(lèi)。

化學(xué)發(fā)光法酶聯(lián)免疫分析系統（Chemiluminescent ELISA）是在免疫反應結束后，加入酶的發(fā)光底物，產(chǎn)生處于激發(fā)態(tài)的中間體。之后中間體會(huì )發(fā)射光子釋放能量以回到穩定的基態(tài)，此發(fā)光強度可由光度計（Luminometer）進(jìn)行檢測，并利用標準曲線(xiàn)計算出被測物的含量。相比于比色法，化學(xué)發(fā)光法具有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍。

常見(jiàn)的化學(xué)發(fā)光組合是魯米諾（3-aminophthal hydrazide, Luminol）底物與辣根過(guò)氧化物酶反應。魯米諾于 1928 年首次被合成為化學(xué)發(fā)光底物，該底物的發(fā)光反應需要苛刻的條件，發(fā)光暗淡且持續時(shí)間短。

之后研究人員發(fā)現，加入增強劑的增強型魯米諾反應（圖 1）能夠長(cháng)時(shí)間產(chǎn)生明亮且穩定的發(fā)光效果，從而使得其廣泛應用于免疫分析，目前 R&D Systems® 的 QuantiGlo® 系列及 Novus Biologicals® 的 Chemiluminescent ELISA 均采用此原理。

圖 1：增強 luminol/peroxide 底物用于化學(xué)發(fā)光檢測

QuantiGlo® ELISA Kit 的基本檢測步驟

第一步：向包被有捕獲抗體的微孔板中加入樣品或標準品，孵育使分析物與包被的抗體結合，將未結合的其他分子清洗掉。

第二步：加入 HRP 偶聯(lián)的抗體（檢測抗體）并與一抗捕獲的分析物結合。未結合的檢測抗體被沖洗掉。

第三步：加入增強的魯米諾底物，使之與 HRP 反應發(fā)光，發(fā)光強度與樣品中存在的分析物數量成正比。利用微孔板光度計測量發(fā)光強度。

QuantiGlo® 試劑盒檢測參數設置及應用舉例

如 QuantiGlo® 試劑盒說(shuō)明書(shū)所列，光度計設定可以使用以下參數或同等參數：1.0 分鐘滯后時(shí)間、檢測時(shí)間 0.5 秒/孔、求和模式、自動(dòng)增益或同等。

需要注意的是：

相對光單位（Relative light units，RLUs）數值由不同光度計檢測可能不同，需要按照儀器制造商的建議調整設置。

相對光單位的數值可能在 15 分鐘的閱讀窗口期間內發(fā)生變化，由于需要參考標準曲線(xiàn)數值換算，所以這并不會(huì )影響結果。

應用舉例 1：Human VEGF QuantiGlo ELISA Kit（貨號 QVE00B）

使用 MOLECULAR DEVICE 品牌的 SpectraMax® L 微孔板化學(xué)發(fā)光酶標儀進(jìn)行檢測（SpectraMax® M5/M5e 和 FlexStation® 3 多功能酶標儀的化學(xué)發(fā)光檢測模式也適用）。數據的收集和計算推薦由 SoftMax® Pro 軟件完成，其預設的模板極大地簡(jiǎn)化了相應流程。

實(shí)驗步驟及儀器參數設置：

1. 每孔加入 150 μL 實(shí)驗稀釋液 RD1-8；

2. 在微孔板中按 3 復孔形式加入 50 μL 標準品或空白對照（Calibrator 稀釋液）。室溫輕度振蕩（推薦  500 ± 50 rpm）微孔板 2 小時(shí)；

3. 孵育結束后使用排槍吸干孔內反應液，并用 400 μL 洗滌液清洗 4 遍。最后吸干剩余洗滌液并在干凈的吸水紙上拍干；

4. 每孔加入 200 μL VEGF 復合物，貼上新的粘合帶。室溫輕度振蕩 (推薦 500± 50 rpm) 微孔板 3 小時(shí)；

5. 按照步驟 3 進(jìn)行清洗步驟；

6. 每孔加入 100 μL Glo 工作液，室溫避光孵育 5 至 20 分鐘；

7. 用 SpectraMax® L 微孔板化學(xué)發(fā)光酶標儀測定 RLU 值。相關(guān)參數如下：1 秒檢測時(shí)間，PMT 自動(dòng)和 470 nm 目標校準波長(cháng)。

結果：顯示由 SpectraMax® L 微孔板化學(xué)發(fā)光酶標儀按照上述的參數所得的 VEGF 標準曲線(xiàn), 其動(dòng)態(tài)范圍超過(guò) 4 個(gè)數量級，計算所得的檢測限，也就是空白對照信號標準差 3 倍值的相應量為 1.5 pg/mL，與該試劑盒平均檢測下限為 3.3 pg/mL 相符。

圖 2，20,000-1.3 pg/mL 的標準品檢測曲線(xiàn)圖。實(shí)驗由 SpectraMax® L 微孔板化學(xué)發(fā)光酶標儀按照 1 秒檢測時(shí)間，PMT 自動(dòng)和 470 nm 目標校準波長(cháng)的參數進(jìn)行讀取。標準曲線(xiàn)由 SoftMax® Pro 軟件繪制。

應用舉例 2：Human IL-6 QuantiGlo ELISA Kit（貨號 Q6000） 

使用 DYNEX TECHNOLOGIES 品牌的 MLX™ 微量滴定光度計測量光的強度，繪制標準曲線(xiàn)，并分析結果。由于底物發(fā)光持續時(shí)間長(cháng)，所以閱讀窗口期可以是加入底物后的 20~40 分鐘之間。實(shí)驗步驟均嚴格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

儀器參數設定：

① 起始模式（Start Mode）：1 分鐘滯后時(shí)間

② 振蕩及溫度設定：關(guān)閉（Off）

③ 檢測選項：

• 自動(dòng)讀取 (Auto Gain)
• 求和模式 (Sum all Readings)
• 檢測時(shí)間 1 秒/孔

軟件操作：

① 只含有校準稀釋液（Calibrator Diluent）的標準品零值孔被定義為空白孔（Blank）：
含有其他不同濃度標準品的孔被定義為 S1-S5 孔。
含有陽(yáng)性對照（Control）的孔根據對應標簽使用「用戶(hù)可定義的類(lèi)型（User Definable Types）」定義為 LL、L、M、H。
含有樣本的孔需定義為測試品（Tests）。

② 在空白模式窗口中，選擇平均（Average）。將所有空白孔（標準品零值孔）取平均值，其他孔值將統一減去這個(gè)平均值。

③ 在曲線(xiàn)擬合（curve fit）窗口中，輸入 S1-S5 的 IL-6 標準品濃度，并在相對光（Relative Light）窗口使用 log/log Cubic Spline 模式擬合并繪制曲線(xiàn)。

④ 數據矩陣（Data Matrix）及擬合曲線(xiàn)圖將呈現在測試報告（Test Report）中。

結果：

——「喔，我明白了，師兄選這個(gè)盒子是考慮到實(shí)驗組間樣本中目標分析物的含量差異大，過(guò)多的稀釋操作一方面費時(shí)費力，另一方面容易造成誤差對吧，師兄果然厲害！」

——「其實(shí)，主要還是因為我懶……」

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